Диагностика инфекций, вызываемых стафилококками
Медицинская теория, материалы / Диагностика инфекций, вызываемых стафилококками
Страница 4

Нами предложен более экономичный метод для обнаружения ДНК-азы у микроорганизмов. Этот способ, помимо уменьшения в 2 раза расхода ДНК на каждый опыт, позволяет использовать более дешевую низкополимерную нуклеиновую кислоту, изготовляемую Олайнским заводом химических реактивов. Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и по качеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее подробное описание.

Для приготовления рабочего раствора ДНК, навеску нуклеиновой кислоты из расчета 10 мг/мл помещают в дистиллированную воду, добавляют 0,5 мл 0,2% (или 0,8%) раствора NaOH на каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНК смесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемешивании стеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. К расплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК из расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА—1 мл раствора ДНК), перемешивают, разливают по10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в автоклаве при 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения— 1—2 мес.

При постановке опыта столбики агара с ДНК растапливают, в водяной бане добавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают и выливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашки Петри и вновь подсушивают. Суточную агаровую культуру засевают маленькими бляшками (диаметр равен 2—2,5 мм) или штампом-репликатором не более 20—25 бляшек, во избежание слияния зон деполимеризации ДНК. После 18—20-часовой инкубации поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3—5 мин учитывают зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.

При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах.

Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный метод Кристи с сотр.

Среда Кристи—Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт—0,45 г, пептон—0,75 г, хлористый натрий—1,2 г, агар—2,75 г, вода—130 мл, рН среды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок.

Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15—20% стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65—70°С в течение 2— 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культуры засевают “пятнами” по 15—20 на чашку. Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки.

Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в комплексе с другими признаками активности.

Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949).

Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15—20 мин. Затем в каждую пробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кислоты микробным ферментом.

Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом, предложенным Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов.

С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.

На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1—2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего учитывают результаты.

Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами

Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это “тепло-холодовый” токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Однако образование дельта-гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно использовать эритроциты барана и человека или лошади.

Страницы: 1 2 3 4 5

Смотрите также

Обучающий эксперимент в патопсихологии, его значение для дифференциальной диагностики олигофрении и задержки психического развития
Обучающий эксперимент — форма естественного эксперимента, который характеризуется тем, что изучение тех или иных психических процессов происходит при их целенаправленном формировании. При этом с по ...

История открытия витаминов
Ко второй половине 19 века было выяснено, что пищевая ценность продуктов питания определяется содержанием в них в основном следующих веществ: белков, жиров, углеводов, минеральных солей и воды. Счи ...

Морфилонг
Морфилонг[4] является пролонгированной формой морфина гидрохлорида. Представляет собой 0,5% раствор морфина гидрохлорида в 30% водном растворе поливинилпирролидона с молекулярной массой 3500±5000. ...